Влияние полиморфизма гена Apo E на исход терапии ВГС

Введение

Уникальной особенностью ВГС является то, что фундаменом репликации РНК и сборки вирионов (в клетках-хозяевах) в равной мере является метаболизм холестерина и биосинтез жирных кислот. Аполипопротеин E (Apo E), лиганд для рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLr), как недавно было установлено является незаменимым компонентом липидного взаимодействия посредством участия на нескольких стадиях жизненного цикла вируса, включая внутриклеточную вирусную сборку. Apo E хорошо описан в качестве главного регулятора многих этапов липидного обмена и метаболизма липопротеинов, включая синтез и секрецию липопротеинов очень низкой плотности (VLDL), гидролиз VLDL для получения липопротеинов низкой плотности (LDL) и опосредованного удаления оставшихся липопротеиновых остатков (остатки VLDL и Chylomicrons) печенью. Липовирусные частицы (LVP) были идентифицированы как вирионы ВГС низкой плотности, упакованные как LVP с плотностью подобной липопротеинам очень низкой плотности (VLDL), а так же обилием Apo E на их поверхности, обнаруженной с помощью электронной микроскопии, что проливает свет на импликацию Apo E, опосредующую инфекционную активность ВГС взаимодействуя с рецепторами липопротеинов. Эндоцитоз ВГС опосредуется рецепторами липопротеинов низкой плотности (LDLr) и рецептором B1 (Sc-B1). LDLr обычно переносит два разных класса холестерина, содержащих липопротеиновые частицы (LDL & VLDL), которые содержат несколько копий Apo E. В то время как Sc-B1, который экспрессируется в основном в печени, взаимодействует с широким спектром липопротеиновых лигандов (HDL, LDL, VLDL и окисленный LDL).

Apo E это полиморфный белок. Ген Apo E широко изучался и описывался как расположенный на 19 хромосоме и тесно связанный с комплексом генов Apo C-I / C-II. Сообщалось о трех основных аллелях: Epsilon-2, Epsilon-3 и Epsilon-4. Изоформы белка apoE2, apoE3 и apoE4, отличаются только одной аминокислотой на двух остатках. Когда apoE2 содержит цистеин с двумя остатками 112 и 158, а Apo E4 имеет аргинин в обоих положениях, в то время как apoE3 имеет цистеин у остатка 112 и аргинин у остатка 158. Менее 0,1% населения имеют дополнительно два незначительных аллеля гена, ε1 и ε5. Три гомозиготных (E2 / E2, E3 / E3, E4 / E4) и три гетерозиготных (E2 / E3, E2 / E4, E3 / E4) генотипа будут определяться этими тремя основными аллелями.

Это исследование было проведено с целью определения значимости полиморфизма гена Apo E для результатов терапии ВГС и можно ли использовать значения полиморфизма в качестве биомаркеров риска, равно как и прогноза исхода ВГС-инфекции.

 

 

Материал и методы

Пациенты

В исследование были включены 245 пациентов, 125 хронических случаев ВГС (не реагирующих на интерферон и рибавирин), 120 пациентов, достигших УВО24 (у которых была отрицательная ВГС-РНК через 6 месяцев после завершения 48-недельной терапии).

Участники были набраны из клиники гепатологии Национального исследовательского центра и Института печени Каирского университета. Протокол исследования соответствовал этическим принципам Хельсинкской декларации 1975 года и был одобрен этическим комитетом национального исследовательского центра (Египет), все пациенты давали письменное информированное согласие на участие.

Лабораторные исследования

Образец периферической крови был получен у участников. Непосредственное центрифугирование проводили в течение 10 мин при 5000 об/мин при 4°С. Центрифугированную сыворотку переносили в стерильные пробирки. Все образцы хранили при -20 ° C до анализа. Один мл образца венозной крови собирали в ампулах ЭДТА для экстракции геномной ДНК.

Общий холестерин, HDL-холестерин (HDL-C), триглицериды и холестерин с очень низкой плотностью измеряли стандартными автоматизированными ферментативными методами с использованием анализатора Olympus AU400 (Olympus, Diagnostica, Japan). LDL-холестерин (LDL-C) рассчитывали с использованием уравнения Фридевальда. Сывороточный LDL-c рассчитывали по этой формуле, поскольку уровень TG не превышал 400 мг/дл: LDL-c = общий холестерин-(TG/5 + HDL-c).

Обнаружение и генотипирование вируса гепатита С

Присутствие антител ВГС в сыворотке было обнаружено с помощью ELISA с использованием иммуноферментного анализа с использованием энзима третьего поколения; CTK-Bioteck-США).

Вирусную РНК извлекали из плазмы пациента с использованием набора QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя. РНК ВГС определяли с помощью набора PCR от Toyobo RNA-direct в реальном времени на системе LG Lifescience, Korea.

Генотип ВГС определяли методом анализа обратной линии (INNO-LIPA v.1.0, innogenetics, Ghent, Belgium) в соответствии с инструкциями производителя. Это наиболее широко используемые методы генотипирования ВГС, где 5 'UTR HCV амплифицируют биотинилированными праймерами, после чего гибридизуют с мембраной, пропитанной генотипическими зондами, и детектируют стрептавидином, связанным с колориметрическим детектором. Набор LiPA-I включал 17 зондов: общий 1 (2 зонда), 1a, 1b, общий 2 (2 зонда), 2a (2 зонда), 2b (2 зонда), 3a (4 зонда) и 4/5 ( 3 зонда).

Генотипирование Apo E

Мы применили qPCR Real-Time с использованием SYBR ** Green I для быстрого генотипирования аллелей гаплотипа Apo E в соответствии с методологией, описанной Андре в 2004 году с небольшими изменениями. Определение гаплотипа Apo E на основе дифференциальной амплификации аллелей с использованием разработанных наборов праймеров, которые содержат конкретные терминальные базы для SNP. Амплификация выполнялась на Applied Biosystems 7500.

Праймеры, используемые в реакции:

Прямые праймеры соответствуют SNP в позиции 3937:

Р (Т): 5'GGA-CAT-GGA-GGA-ВКТ-С (Т) -3'
F (C): 5'GGA-CAT-GGA-GGA-ВКТ-О (С) -3'

 

Обратные праймеры соответствуют SNP в позиции 4075:

R (G): 5'-GGT-АСА-CTG-CAG-GC (G) -3'
R (A): 5'-GGT-АСА-CTG-CAG-GC (А) -3'

 

Праймеры амплифицировали амплификатор 169bp из общей геномной ДНК.

Реакции с использованием праймеров, в которых отсутствует SNP-interrogating нуклеотид, были выполнены в качестве контроля.

F (поз): 5'-GGG-АСА-TGG-AGG-ACG-ТГ-3'
R (поз): 5'-TGG-ТАС-АКТ-GCA-GGC-3'

 

Работы производились с использованием системы PCR StepOne™ Real-Time (Applied Biosystems, CA), со следующими циклическим параметрам: 95°С в течение 15 мин, затем 50 циклов 94°С в течение 15с с целью денатурации, и 60°С в течение 30с для отжига, 72°С в течение 30с для расширения. В окончании, 72°С в течение 10 мин.

Определение гаплотипа

Каждый образец ДНК проводили в пяти реакциях ПЦР: четыре реакции с различными комбинациями SNP-interrogating прямого и обратного праймеров и положительной контрольной реакции. Мониторинг накопления продукта во время экспоненциальной фазы амплификации, в отличие от традиционного анализа конечных точек, для этого протокола очень важен, поскольку реакции с совпадением или несоответствиями праймеров могут в конечном итоге накапливать эквивалентные количества продуктов.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с использованием SPSS Statistics версии 17 (SPSS Inc., Chicago, IL). Нормальность численного распределения данных исследована с помощью теста Д'Агостино-Пирсона. Параметрические числовые переменные были представлены как среднее ± SD, а межгрупповые различия были сопоставлены с использованием непарного T-критерия при сравнении двух групп и одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), а затем пост-специального теста для сравнения более чем двух групп. Распределения аллельных и генотипических частот исследуемого SNP учитывали равновесие Харди-Вайнберга. Категориальные переменные были представлены в виде числа и процента, а межгрупповые различия сравнивались с использованием точного критерия Фишера. Категориальные переменные сравнивались с использованием критерия хи-квадрат и коэффициента шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Статистически значимым считалось значение р 0,05.

 

 

Результаты

В этом исследовании были включены пациенты в том числе и с 4 генотипом. Сто двадцать пять оказались хронически больны вирусным гепатитом С, а 120 из них достигли УВО. Общий возрастной диапазон составил от 20 до 50 лет.

Сравнение липидного профиля между хроническими случаями ВГС и субъектами достигшими УВО было суммировано в таблице 1. Имеются статистически значимые различия между двумя группами в отношении уровней холестерина и уровня ЛПНП: пациенты с хронической ВГС-инфекцией имели более низкий уровень холестерина и ЛПНП по сравнению с субъектами достигшими УВО (P .001), В тоже время статистически значимых различий в отношении уровней триглицеридов, HDL и VLDL не было.

Распределение генотипа Apo E были сопоставлены между двумя группами и суммированы в таблице 2. Статистически значимые различия в отношении генотипов Apo E между двумя группами (значение P <0,001) были установлены — уровень E3E3 был значительно выше среди пациентов с ВГС, в тоже время как генотипы E3E4 и E4E4 были распространены больше среди группы пациентов достигших УВО (значение P <0,001). Генотип E3E3 ассоциируется с повышенным риском хронической ВГС инфекции (OR 4.7, 95% CI 1.9-12.1). Кроме того, были статистически значимые различия в частотах аллелей E3 и E4, где аллель E3 демонстрирует более высокую распространенность среди группы пациентов с ВГС, тогда как группа достигших УВО показала более высокое распространения аллеля E4 (значение P <0,05). Анализ различных аллелей Apo E и распространения хронической ВГС инфекции среди изученных групп показал, что носители аллеля E3 имеют риск развития ВГС в 1,4 раза больше, чем у аллелей E4 (OR 1,4, 95% ДИ 1,0-2,0). Кроме того, защитная аллель E2 отсутствовала у всех без исключения инфицированных участников.

Суммарное сравнение уровня липидов в сыворотке среди разных генотипов показано в таблице 3. Несмотря на то что уровень общего холестерина и ЛПНП в сыворотке крови у носителей E3 ниже, чем у носителей E4, эта разница не является статистически значимой.

 

Обсуждение

Аполипопротеин E — основной структурный LDL-компонент и природный лиганд LDLR, который тесно связан с метаболизмом липопротеинов плазмы и может оказывать влияние на течение ВГС. Были идентифицированы три изоформы Apo E: E2, E3 и E4. Мы установили что генотипы Apo E могут оказать значительное влияние на патологию и прогноз ВГС.

В настоящем исследовании изучалась возможная связь между полиморфизмом Apo E и исходом ВГС-инфекции: были продемонстрированы статистически значимые различия в отношении распределения генотипов Apo E между ВГС-пациентами и субъектами достигшими УВО (значение P <0,001), при этом частота распространения E3E3 была значительно выше среди пациентов с хронической ВГС-инфекцией, в то время как распространение генотипов E3E4 и E4E4 была выше в группе субъектов достигших УВО (значение P <0,001), генотип E3E3 ассоциировался с повышенным риском хронической инфекции и неуспешной противовирусной терапии (OR 4.7, 95% CI 1.9-12.1). Анализ различных аллелей Apo E и распространения хронической ВГС инфекции среди изученных групп показал, что носители аллеля E3 имеют риск развития ВГС в 1,4 раза больше, чем у аллелей E4 (OR 1,4, 95% ДИ 1,0-2,0). Кроме того, защитная аллель E2 отсутствовала у всех без исключения инфицированных участников.

Эти данные дают основания полагать, что аллель Аро E3 ассоциируется с высоким риском ВГС инфекции, но также указывает на высокую вероятность того, что носители аллелей Apo E4 имеют хороший ответ на противовирусную терапию, что совокупно подчеркивает правоту сложившейся гипотезы, которая говорит об уменьшении экспрессии LDL-R у данной группы. Носители обладающие аллелью E3 потенциально демонстрируют меньшую виремию и большую устойчивость.

В соответствии с полученным результатом Price (2006) сообщил, о связи генотипа E3E3 с наибольшим риском развития хронической инфекции гепатита С, в особенности у пациентов из кавказского региона пациентов, в то время как аллель E4 благоприятствует прохождению противовирусной терапии. Аналогичным образом, Mueller (2016), в своей работе сделал заключение о снижении восприимчивости к ВГС среди носителей Apo E4 . Более того, Teama (2016) поддержал возможную генетическую связь между аллелем Apo E4 с меньшей вероятностью прогрессирования хронического гепатита к исходу в цирроз печени. С таким же уважением, Kuhlmann (2010) сообщил, что специфический защитный (для ВГС) эффект и механизм связанный с Аpo E4, приводит к низким темпам развития фиброза среди носителей E4.

В некоторых исследованиях была описана связь между хронической ВГС-инфекцией и липидным обменом. Более высокая распространенность гипохолестеринемии и низкие уровни ЛПНП у пациентов с ВГС-инфекцией отмечалась во многих исследованиях.

Это исследование показало, что у пациентов с хроническим ВГС достоверно снижается уровень общего холестерина и уровня ЛПНП по сравнению с группой с УВО (значение Р <0,001 для обоих). Синтез внутрипеченочного холестерина может быть нарушен из-за репликации ВГС по двум возможным путям; во-первых, снижение доступности геранилпирофосфата для синтеза холестерина. Во-вторых, холестерин может быть использован для синтеза внутриклеточных мембран во время репликации вируса. Оба механизма приводят к отрицательной обратной связи по количеству холестерина, доступного для физиологических внутриклеточных процессов, следовательно, уровни холестерина в сыворотке будут уменьшаться. Кроме того, снижение уровня ЛПНП в сыворотке крови при ВГС-инфекции может произойти из-за уменьшения доступного внутриклеточного холестерина, который может также влиять на LDL-рецепторы, что приводит к увеличению внутрипеченочного ЛПНП с последующим снижением уровня ЛПНП в сыворотке. Хотя между генотипами Apo E относительно уровня холестерина и уровня ЛПНП не было выявлено статистически значимой разницы, их уровни были ниже у носителей аллелей E3. Аналогичные результаты были получены также Marzouk (2007), Corey (2009) и Nashaat (2010).

Совокупно, эти результаты пролили свет на главенство роли ApoE в производстве LVP, предположительно путем прямого взаимодействия с гликопротеинами вирусной оболочки. Lee et al., 2014 предположили, что ApoE действует на финальной стадии сборки, такой как созревание вирусных частиц, в то время как истощение запасов ApoE не повлияло на образование нуклеокапсидов. Дальнейшее изучение LVP показало, что связывание HCV-LVP, взаимодействие с гепатоцитами и повышение активности рецепторов LDL с последующим увеличением их интернализации могут быть блокированы антиаполипопротеином E.

Безусловно, продемонстрированные в этом исследовании объективные данные, в случае дальнейшего подтверждения взаимодействия ApoE с ВГС, можно считать надежным биологическим маркером который необходимо учитывать при разработке новых стратегий терапии хронического гепатита С.

 

 

Заключение

В этом исследовании подтверждается гипотеза роли защитного механизма связанного с аллелью Аро E4, которая способствует достижению устойчивого вирусологического ответа при проведении противовирусной терапии, в то время как аллель Аро E3 является специфическим маркером риска устойчивости ВГС и неудачной терапии, в то время как аллель Аро E2 обеспечивает устойчивость пациента к ВГС-инфекции во время инфицирования.

 

 

Источник:

Journal of Genetic Engineering and Biotechnology
Volume 16, Issue 1, June 2018, Pages 47-51

https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2017.10.008

Коллектив авторов:

Howayda E.Gomaa, Mohamed Mahmoud, Nevine E.Saad, Amal Saad-Hussein, Somaia Ismail, Eman H. Thabet, Hebatallah Farouk, Dina Kandil, Ahmed Heiba, Wael Hafez

Clinical Pathology Department, National Research Centre, El-Behoos Street, Giza, Egypt

Internal Medicine Department, National Research Centre, Egypt

Environmental and Occupational Medicine Department, National Research Centre, Egypt

Medical Molecular Genetics Department, National Research Centre, Egypt