Профилирование экспрессии генов CD133 клеток при ГЦК

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью печени. Она занимает пятое место по распространению и третье среди причин смерти от онкологических заболеваний во всем мире. Несмотря на успехи в обнаружении и лечении ГЦК, она зачастую остается неизлечимой из-за позднего обнаружения и высокой частоты рецидивов данного заболевания. Уровень заболеваемости ГЦК варьируется в зависимости от распространенности вируса гепатита B (ВГВ) и вируса гепатита C (ВГС), которые являются основными факторами риска для ГЦК. В Египте заболеваемость ГЦК возрасла в 8 раз за последнее десятилетие из-за высокой распространенности ВГС, поскольку она, по примерным оценкам, затрагивает около 12% населения.

Недавние исследования показали, что рак является болезнью, тесно связанной с изучением взрослых стволовых клеток — данные клетки являются единственными клетками, которые находятся в ткани в течение длительного времени, достаточными для получения необходимого количества генетических мутаций для неопластической трансформации. Кроме того, собирается все большее количество доказательств гипотезы «раковых стволовых клеток», которая показывает, что злокачественная трансформация стволовых клеток и клеток-предшественников печени (стволовых клеток печени) является одним из источников гепатоцеллюлярной карциномы.

Раковые стволовые клетки (РСК) определяются как небольшая субпопуляция клеток, расположенных внутри опухолей, которые обладают способностью к самообновлению, дифференцировке и опухолегенности при трансплантации, и, соответственно, эти клетки, скорее всего, ответственны за неудачу при проведении лечения, возникающие рецидивы и метастазы. РСК печени были идентифицированы среди нескольких подтипов ГЦК, и на данный момент они считаются основными регуляторами для инициации, метастазирования и прогрессирования ГЦК. CD133 представляет собой трансмембранный гликопротеин Penta Span. Это поверхностный маркер как для нормальных стволовых клеток печени, т.н. «овальных клеток», так и для РСК в клеточных линиях ГЦК.

Раковые стволовые клетки печени и нормальные стволовые клетки печени имеют большое фенотипическое сходство. Однако, важно различать их на генетическом уровне, что может помочь лучше понять механизмы гепатокарциногенеза, а также улучшить методы и стандарты проведения лечения. В данном исследовании мы стремились дифференцировать на генетическом уровне CD133+ клетки, полученные от пациента с ГЦК, и CD133+ клетки, полученные от нормального контроля.

 

Методы

CD133+ клетки были отобраны из периферической крови пациентов с ГЦК, а также взяты у здоровых добровольцев с помощью магнитной сортировки активированных клеток. Дифференциальный профиль экспрессии генов, связанных со стволовыми клетками, проводили с помощью ПЦР-профилирования стволовых клеток.

 

Результаты

Анализ данных о связанных с стволовыми клетками генах в CD133+ клетках у группы с ГЦК по сравнению с контрольной группой показал, что: CCND2, COL1A1, CTNNA1, DLL3, JAG1, KRT15, MYC, NOTCH2, T и TERT были повышены (кратное изменение = 80, 68,6, 6,67, 7,22, 3,8, 15,2, 14,5, 105,6, 26,6 и 99 соответственно), в то время как CD3D была снижена (кратное изменение = 0,055) у пациентов с ГЦК, однако после применения поправки Беферрони для корректировки Р-значения, KRT15 был единственным геном, который значительно выражен в CD133+ клетках у пациентов с ГЦК по сравнению с контрольной группой (значение Р = 0,012).

Обсуждение

Роль раковых стволовых клеток (РСК) в инициировании и прогрессировании опухоли подтверждена для ГЦК. Эти РСК обладали характеристиками похожими на нормальные тканевые стволовые клетки, включая самообновление, дифференцировку и способность образовывать новые опухоли. Таким образом, ввиду инвазивных и лекарственно-устойчивых способностей, эти клетки могут быть ответственны за рецидив рака и метастазирование.

На текущий момент общепризнано, что CD133 является маркером как для тканевых стволовых клеток, так и для раковых стволовых клеток (РСК). Поверхностный маркер CD133 использовался для выделения стволовых клеток из нормальной ткани печени, а также для выделения субпопуляции РСК из злокачественной опухоли. Увеличение количества CD133 коррелировало с более агрессивным течением заболевания, стадией и предполагало снижением общей выживаемости.

Хронический вирусный гепатит считается основным фактором риска ГЦК — более 90% пациентов с ГЦК либо имеют ВГВ, либо ВГС. Недавнее исследование Ali связали экспрессию субгеномного репликона ВГС в клетках культуры с получением РСК. Кроме того, присутствие ВГС в тканях ГЦК способствует экспрессии белков связанных со стволовыми клетками: CD133 и c-MYC.

В данном исследовании мы использовали анализ профилирования ПЦР Stem Cell для определения профиля экспрессии из 84 родственных стволовым клеткам генов в CD133+ клетках, полученных как от пациентов с ГЦК, так и сравнили с контрольной группой здоровых добровольцев. Наши данные показали, что профиль CD133+ клеток в группе ГЦК имеет значительные генетические изменения в раковых стволовых клетках по сравнению с результатами, полученными от здоровых добровольцев, хотя оба имеют одинаковые фенотипические признаки и генетический маркер. Наше исследование показало, что десять генов имели значительное увеличение экспрессии (CCND2, COL1A1, DLL3, JAG1, KRT15, CTNNA1, MYC, NOTCH2, T и TERT), и только экспрессия одного гена (CD3D) была значительно снижена в CD133+ клетках ГЦК.

Сигнальный путь Notch, который представлен Notch2 и его двумя лигандами (JAG1 и DLL3), показал регулирующие действие в CD133+ клетках группы ГЦК по сравнению с контрольной. Путь Notch участвует во многих важных процессах, таких как дифференцирование, некроз, пролиферация, апоптоз и клеточная адгезия. Кроме того, путь Notch играет важную роль в поддержании и гомеостаза, а так же в процессе канцерогенеза. Аберрации, влияющие на сигнальные гены Notch, были зарегистрированы во многих различных типах рака: молочной железы, легких, колоректального рака, поджелудочной железы и печени.

Аналогичным образом JAG1 имеет высокий уровень экспрессии во многих видах онкологических заболеваний. Он играет важную роль в росте опухолевых клеток, ангиогенезе и метастазировании, индукции и поддержании популяции стволовых клеток, эпителиально-мезенхимальном переходе и резистентности к терапии при нескольких типах рака. JAG1, по-видимому, является основным лигандом, управляющим сигнальным путем Notch РСК. Предыдущее исследование дало основание связать JAG1 с количественным значением объема опухоли ГЦК, вероятно, поддерживая высокое значение объема раковых стволовых клеток, что обусловило негативные результаты терапии.

Активность CCND2 и MYC — генов, регулирующих клеточный цикл, показала увеличение в CD133+ клетках у пациентов с ГЦК по сравнению с контрольной группой. Аналогично, Park сообщал о CCND2 связанным с развитием опухолевого процесса. Кроме того, транзиторная избыточная экспрессия циклина D1, D2 или D3 может спровоцировать пролиферацию гепатоцитов и рост печени in vivo.

Ген c-MYC является одним из наиболее часто активируемых онкогенов, которые участвуют в развитии и прогрессировании многих онкологических заболеваний, включая ГЦК. Он также участвует в регуляции 15% генов в геноме человека. Более того, c-MYC является важным регулятором самообновления и плюрипотентности клеток эмбрионального стебля (ES) и плюрипотентных стволовых клеток. C-MYC необходим для онкогенного перепрограммирования терминально дифференцированных гепатоцитов в РСК ГЦК. Активация C-MYC приводит к дозозависимой до-регуляции генов плюрипотентности и эмбрионального стебля, таких как NANOG, OCT4, BMI1, SOX2 и EpCAM, с соответствующим увеличением способности к образованию опухоли в нескольких линиях клеток гепатомы.

Ген COL1A1 был экспрессирован в инвазивных образцах ГЦК. Более того, регуляторы обоих генов COL1A1 и COL1A2 увеличивали синтез коллагена I типа и способствовали росту и метастазированию ГЦК.

T (Brachyury) является транскрипционным фактором в комплексе генов T-box. Он расположен в регионе 6q27, активность которого зачастую усиливается при ГЦК. Недавно накопленные и обобщенные данные достоверно показали, что T (Brachyury) играет существенную роль в канцерогенезе и метастазировании множественных типов опухолей и может служить маркером прогноза развития заболевания. Недавнее исследование Du показало, что T уровень активности (Brachyury) был значительно выше в тканях ГЦК по сравнению с соседствующими тканями. Его экспрессия коррелирует с размерами опухоли, внутрипеченочной инвазией, возникновением метастазирования на расстоянии и негативным результатом лечения ГЦК. Это исследование свидетельствует о том, что T (Brachyury) может играть критическую роль в метастазировании ГЦК посредством индукции ЕМТ используя путь PTEN/AKT/Snail. В другом исследовании, посвященном колоректальным раковым клеткам, были подтверждены эти данные и показано, что T (Brachyury) задает характеристики раковым стволовым клеткам посредством регуляции гена NANOG в них.

TERT служат в качестве компонента обратной транскриптазы теломеразы, белка с несколькими субъединицами. TERT имеет важное значение для поддержания длины теломер и играет критическую роль для стволовых клеток, старения и онкологических заболеваний. Этот фермент экспрессируется в 70-90% раковых клеток, который реактивируется во время канцерогенеза и имеет важное значение для ничем не ограниченной пролиферации раковых клеток. Установлено, что длинные теломеры и повышенная активность теломеразы являются значительными плохими прогностическими факторами лечения ГЦК и связаны с клинико-патологическими особенностями агрессивности опухоли.

В данном исследовании мы установили чрезмерное повышение уровня TERT в CD133 клетках РСК, что согласуется с данными Kim который сообщил, что ГЦК, экспрессирующие белки, связанные с эмбриональным стеблем (CD133, K19 и EpCAM), характеризуются повышенной длиной теломер, повышенной экспрессией сложных белков (hTERT и shelterin) и повышенной хромосомной нестабильностью по сравнению с обычными злокачественными клетками ГЦК.

Основываясь на данных нашего исследования, мы заключаем, что CD133+ клетки, полученные от пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой, демонстрируют аберрантную экспрессию CCND2, COL1A1, DLL3, JAG1, KRT15, CTNNA1, MYC, NOTCH2, T и TERT по сравнению с CD133+ клетками, полученными от здоровых добровольцев. Эти аберрации могут быть ответственны за развитие и прогрессирование ГЦК. Эти данные могут иметь важное значения в плане прогнозирования эффективности предстоящего лечения и улучшения общей выживаемости среди пациентов с данным заболеванием. Однако, полученные данные должны быть подтверждены в более широком исследовании с использованием большого размера выборки.

 

Источник:

«Gene expression profiling of circulating CD133+ cells of hepatocellular carcinoma patients associated with HCV infection»
Journal of the Egyptian National Cancer Institute
Volume 29, Issue 1, March 2017 , Pages 19-24

https://doi.org/10.1016/j.jnci.2016.12.002

 

Коллектив авторов:

Abdel-Rahman N.Zekri, EnasR.El-Sisi, Zeinab F.Abdallah, Alaa Ismail, Ahmed Barakat Barakat

Molecular Virology and Immunology Unit, Cancer Biology Department, National Cancer Institute, Cairo University, Cairo, Egypt
Surgery Department, Faculty of Medicine, Ain Shams University, Cairo, Egypt
Microbiology Department, Faculty of Science, Ain Shams University, Cairo, Egypt